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人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF-8)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書
檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF-8)獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF-8)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量shengli鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
酶標(biāo)儀(450nm)
高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
試劑盒保存在2-8℃,使用室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對(duì)照或者空白;預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋,直接取10μL加樣即可。
嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
所有液體組分使用充分搖勻。
試劑盒組成:
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標(biāo)板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無(wú) |
標(biāo)準(zhǔn)品(160pg/ml) | 0.6mL | 0.6mL | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
底物B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
說明書 | 1份 | 1份 | 無(wú) |
自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
注:標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為:160、80、40、20、10、5pg/ml
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF-8)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書
操作步驟
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;
待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;
隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。
2. 靈敏度:低檢測(cè)濃度小于1.0 pg/ml。
3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
6. 有效期:6個(gè)月
免責(zé)聲明
1. 試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn),否則所產(chǎn)生的切后果,由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),本公司概不負(fù)責(zé)。
2. 嚴(yán)格按照說明書操作,實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作,后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。
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