凍存管的冷凍操作是一門學(xué)問(wèn),并不是打開(kāi)液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的??茖W(xué)正確地使用凍存管,可以避免樣本的損失,并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。
凍存管冷凍步驟:
1、用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞,吸取溶液,含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細(xì)胞(薄薄的液層足夠,胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細(xì)胞系確定)。
2、37℃孵育細(xì)胞3-5分鐘。
3、細(xì)胞從底部脫離之后,終止孵育,加入含有血清的培養(yǎng)基,用移液器輕輕地懸浮細(xì)胞。
4、離心細(xì)胞懸液(500xg,5分鐘),用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。
細(xì)胞計(jì)數(shù)
1、離心細(xì)胞懸液(500xg,5分鐘),去除上清液,用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
2、以1:1體積比混合細(xì)胞和凍存液(60%培養(yǎng)基,20%胎牛血清,20%DMSO),然后轉(zhuǎn)移到凍存管中。凍存的細(xì)胞密度為1-5×106個(gè)/毫升。
3、含有細(xì)胞的凍存管建議以?1K/min的速率降溫,可以將凍存管置于?70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲(chǔ)其他樣品,可以直接放置在?20℃,?70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻,4mL和5mL的凍存管需要先置于在?20℃冰箱過(guò)夜,然后再轉(zhuǎn)移到?70℃或者液氮的氣相。
4、然后轉(zhuǎn)移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮,請(qǐng)將凍存管置于液氮的氣相,切勿置于液相。
操作凍存管復(fù)蘇,全程使用安全防護(hù)設(shè)備,建議穿實(shí)驗(yàn)服、戴棉質(zhì)手套且在安全的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行操作。條件允許情況下,請(qǐng)佩戴護(hù)目鏡或防護(hù)面罩。由于夏季室內(nèi)溫度會(huì)高于冬季,請(qǐng)格外小心。凍存細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中,凍存管的冷凍溫度須均勻。不均勻的受凍將會(huì)導(dǎo)致冰塞的產(chǎn)生,冰塞會(huì)抑制兩側(cè)的液體溫度傳遞進(jìn)而產(chǎn)生危險(xiǎn)的高壓力并導(dǎo)致凍存管受損。