服務(wù)熱線
15502280048
植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。 用純化的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包 被單抗的微孔中依次加入植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO),再與 HRP 標(biāo)記的 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗 滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相關(guān)。用酶 標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中植物 1,5-二磷酸核酮 糖羧化酶(RubisCO)濃度。
試劑盒組成:
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶
7 終止液 6ml×1 瓶 2 酶標(biāo)試劑 6ml×1 瓶
8 標(biāo)準(zhǔn)品(300ng/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶標(biāo)包被板 12 孔×8 條
9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶 4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶
10 說明書 1 份 5 顯色劑 A 液 6ml×1 瓶
11 封板膜 2 張 6 顯色劑 B 液 6ml×1/瓶
12 密封袋 1 個
植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟 標(biāo)本要求
1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能 馬上進(jìn)行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2.不能檢測含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀 釋。
150ng/L
5 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
75ng/L
4 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
37.5ng/L
3 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
18.75 ng/L
2 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
9.375 ng/L
1 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、 待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl, 然后再加待測樣品 10μl(樣品最終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡 量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此 重復(fù) 5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同 3。
8. 洗滌:操作同 5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
10 分鐘.
10. 終止:每孔加終止液 50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定:以空白孔調(diào)零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
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